مرکز تحقیقات سوءمصرف و وابستگی به مواد

عنوان طرح:

بررسي اثرات سميت مورفين بر كشت سلول­هاي عصبي

علي­ محمد شريفي

1388

مقدمه

آپوپتوز شناخته ­شده ­ترين شکل از مرگ برنامه ­ريزي شدة سلول است که داراي اهميت اساسي در تعادل حياتي بافت­هاي بدن مي­باشد. اين مکانيزم از اجزاي ضروري بسياري از پروسه ­هاي فيزيولوژي طبيعي بدن از جمله تشکيل جنين، تکوين بافت­هاي طبيعي و پاسخ­هاي ايمني محسوب مي­شود، به طوري که افزايش سطح آپوپتوز در بسياري از بيماري­هاي نورودژنراتيو گزارش شده است.

اوپيوئيدها  مواد شيميايي هستند که عملکردي مشابه با مورفين در بدن دارند. آنها مي­توانند به گيرنده­هاي اختصاصي خود در سيستم عصبي مرکزي و همچنين در ديگر بافت­هاي بدن متصل شوند. به طور مثال مورفين بيشترين اثرات فارماکولوژي خود را بر روي سيستم عصبي مرکزي و نيز بافت­هاي دستگاه گوارش اعمال مي­کند.

اوپيوئيدها مي­توانند از طريق دخالت در عملکرد سيستم ايمني ذاتي و اکتسابي باعث افزايش بروز بيماري­هاي عفوني گردند. همچنين تغيير در ميزان دوپامين داخل سلولي و سطح ATP/ADP و نيز افزايش تشکيل راديکال­هاي آزاد اکسيژن که در اثر مصرف اوپيوئيدها در بدن ايجاد مي­شود، منجر به القاء بيماري­هاي نورودژنرتيو مي­گردد. به علاوه مطالعات نشان داده است که اوپيوئيدها  قادر به مهار رشد سلول و از طرفي افزايش مرگ آنها مي­باشند هر چند که مکانيزم­هاي مولکولي آن هنوز به درستي شناخته نشده است.

مطالعات قبلي نشان داده است که آمفتامين و هروئين مي­توانند باعث بروز آپوپتوز گردند. داده­ها حاکي از آن است که مرگ سلول­هاي عصبي تمايز يافتة PC12 در اثر استفاده از اين داروها مي­تواند مربوط به تغيير در ميزان دوپامين داخل سلولي باشد. همچنين مطالعة ديگري نشان داده است که مورفين مي­تواند باعث آغاز پروسة آپوپتوز در سلول­هاي Jurkat و در نهايت  تغيير در FADD و آپوپتوز وابسته به p53 گردد. مورفين همچنين قادر به القاء بيان Fas و در نتيجه آپوپتوز وابسته به آن مي­باشد. البته هنوز مکانيزم­هاي سلولي و مولکولي اثرات مورفين برروي مرگ سلول­ها کاملاً شناخته شده نيست.

هدف از مطالعة حاضر بررسي اثرات مورفين برايجاد آپوپتوز در سلول­ها PC12  به عنوان مدلي از سلول­هاي عصبي مي­باشد. با شناخت سيگنالينگ اثرات مرفين شايد بتوان با مداخله در اين مسير مانع از بعضي از اثرات مضر آن بر بافت عصبي گردد. در اين تحقيق از تکنيک­هاي MTT و DNA laddering به ترتيب براي  نشان دادن ميزان مرگ سلول­ها و قطعه قطعه شدن DNA استفاده شده است. از روش ايمنوبلات به منظور بررسي تغييرات بيان پروتئينBAX  به عنوان يک فاکتور پروآپوپتوتيک استفاده شده است.

مواد و روش­ها:

کشت سلول

سلول­هاي PC12 از انستيتو پاستور تهران تهيه گرديده شد. سلول­ها در°C 37  و 90% رطوبت و 5% CO2 نگهداري شدند. همچنين اين سلول­ها در محيط کشت DMEM شامل 5% سرم جنين گاو، 10% سرم اسب، 100 units/ml پني­سيلين و 100 µg/ml استرپتومايسين کشت داده شدند.

به منظور انجام تکنيک­هاي استخراج MTT سلول­ها در پليت 96 خانه و تعداد 5000 در هر چاهک کشت داده شدند. سپس بعد از گذشت 24 ساعت سلول­ها با مورفين به غلظت  mM1 تيمار داده شدند. همچنين براي انجام استخراج DNA از سلول­هاي کشت داده شده در فلاسک 25سانتيمتر مربع استفاده گرديد.

 تست اندازه ­گيري حيات سلولي MTT :

ميزان زنده بودن سلول­ها به وسيلة تست MTT  انجام شد. به طور خلاصه بعد از اتمام زمان تيمار سلول­ها، محلول MTT (5 ميلي گرم در ميلي ليتر كه در محيط كشت DMEM  تهيه شده است). به چاهك­هاي پليت 96 خآنهاي اضافه كرده و به مدت 1 ساعت در دماي 37 درجه سانتيگراد انكوبه شدند. بعد از خارج كردن محيط، سلول­ها و كريستال­هاي رنگ در DMSO (با اضافه كردن 100 ميكروليتر به هر چاهك) حل شدند و جذب آن به وسيلة دستگاه ELISA Reader  در 570 نانومتر اندازه گيري شد.

آناليز الگوي نردباني DNA

استخراج DNA  به وسيله روشGur  انجام گرفت (1). به طور خلاصه سلول­ها (5×106) به وسيله اتانول 70% فيكس شده و به مدت 24 ساعت در 20 -  درجه سانتيگراد نگهداري شدند. سپس به مدت 30 دقيقه در دماي اتاق در 40 ميكروليتر بافر فسفات-سيتريك اسيد انكوبه شدند. بعد از سانتريفيوژ (5 دقيقه و با دور 1500g)، محلول رويي به وسيله كنسنتراتور خشك گرديد. پودر حاصل به مدت 30 دقيقه در 37 درجه سانتيگراد  با 7 ميكروليتر 25/0% NP-40 و 7 ميكروليتر 1 ميلي گرم در ميلي ليتر RNase  انكوبه شد. بعد از اضافه كردن  7 ميكروليتر 1 ميلي گرم در ميلي ليتر پروتئيناز K  دوباره به مدت 30 دقيقه در 37 درجه سانتيگراد انكوبه شد. مخلوط حاصل بر روي ژل آگاروز 2% و با ولتاژ 85 ولت مورد بررسي قرار گرفت.

 استخراج پروتئين

پروتئين سلول­ها طبق روش برادفورد[1] استخراج شد.

سنجش پروتئين به روش وسترن بلاتينگ

جهت آناليز ايمونوبلات يا وسترن بلاتينگ دو پروتئين Bax و  Bcl 2 تمام سلول­هاي کشت شده توسط SDS buffer  ليز شدند. (40 µg/well) پروتئين روي ژل پلي اکريل آميد 10% قرار داده شد و با ولتاژ 100 الکتروفورز شد، سپس به کاغذ PVDF انتقال داده شد.

 از آنتي بادي  Rabit anti rat Bax و  Bcl- antibody (BD 1:1000)به عنوان آنتي­بادي اوليه و ازanti-rabit كونژوگه بهHRP  به عنوان آنتي­بادي ثانويه استفاده گرديد، باندها با استفاده از انکوبه کردن در الكتروكميلومينسانس سوبستراي   ECLو با استفاده از فيلم راديوگرافي  قابل رؤيت شدند.

 استخراج  و آناليز DNA :

سلول­ها در 10 ml اتانول 70% به مدت 4 روز در c°20-  فيکس شدند. سلول­ها به مدت 5 دقيقه در 1000g سانتريفيوژ شدند و مايع رويي دور ريخته شد. رسوب سلول در 40 ميکروليتر بافر فسفات سيتريک اسيد حل شد، سپس به تيوب­هاي اپندورف  ml5/0 انتقال داده شد و در حرارت اتاق براي 30 دقيقه نگهداري شد. مجدداً در دور 1500  به مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ شد. مايع رويي به يک اپندورف جديد منتقل شد و در دستگاه تغليظ­گر به مدت 15 دقيقه قرار داده شد. سپس 3 ميکروليتر NP40 25/0%  و 3 ميکروليتر RNase  به آن اضافه گرديد و به مدت 30 دقيقه درحرارت 37 درجه انکوبه شد. به هرکدام از لوله­ها10 ميکروليتر پروتئيناز K اضافه شده و در 37 درجه به مدت 30 دقيقه انکوبه شدند.

ژل آگاروز 2%  تهيه شد و نمونه­ها يعني گروه کنترل و گروه­هاي تيمار شده با یک ميلي مولار مرفين به همراه 2 ميکروليتر بافر پركنندة بارگيري در چاهک­ها قرار داده شد و به مدت 40 دقيقه  به ولتاژ 100  ولت متصل شد.

رنگ آميزي33342    Hochset

اين روش رنگ­ آميزي نيز به منظور تشخيص هسته سلول آپوپتوزي به کار مي رود  رنگ Hoechst 33342  کروماتين را رنگ کرده و به کمک ميکروسکوپ فلورسنت قابل رويت مي نمايد. به اين منظور سلول­ها در PBS، (Phosphate Buffered Saline) محتوي 3/7 ميلي­گرم پارا فُرمالدئيد به مدت 30 دقيقه فيکس شدند، پس از فيکس شدن در حرارت اتاق سلول­ها چند بار با محلول PBS شستشو شدند و سپس با 10 ميكروليتر در ميلی­ليتر رنگ Hoechst در حرارت اتاق به مدت 30 دقيقه انکوبه شدند. پس از سه بار شستشو سلول­ها  به وسيلة ميکروسکوپ فلورسنت در طول موج 36  نانومتر قابل رؤيت شدند.

 آناليز آماري:

داده­ها به صورت ميانگين ± خطاي استاندارد ميانگين نشان داده شده­اند. معني­دار بودن اختلاف آماري بين داده­ها به وسيلة ANOVA يك طرفه ويا ازUnpaired-t test  و تست Dunnett  تعيين گرديد. مقدار P كمتر از 05/0 به عنوان  اختلاف  معني­دار تلقي شد.

بحث و نتيجه ­گيري:

علیرغم تحقيقات وسيع در خصوص نورودژنراسيون ناشي از اپيوئيدها، مكانيزم دقيق مرگ سلولي ناشي از مرفين كاملاً واضح و روشن نمي­باشد. در مطالعة اخير بنابراين نشان داده شده است كه مرفين مي­تواند موجب مرگ سلول­هاي عصبي گردد. در مطالعة حاضر نشان داده شده است كه ميزان حيات سلول­هاي PC12 در معرض 1 ميلي­مولار مرفين پس از 96 ساعت به طور معني­داري كاهش يافته است. در اين مطالعه سميت سلولي ناشي از مرفين توسط دو متد مختلف از يك طرف با استفاده از قطعه قطعه شدن DNA و ايجاد نردبانDNA  و از طرف ديگر با استفاده از ميزان بيان پروتئين ژن­هاي به ترتيب پروآپوپتوتيك و آنتي­آپوپتوتيكBax  و Bcl2 مورد مطالعه قرار گرفت كه توسط رنگ آميزي سلول­ها به توسط هوخست نيز تأیيد گرديد.

نردبان DNA از مشخصه­هاي مورفولوژيك آپوپتوز بوده كه با شكسته شدن  DNAبه قطعات 180-200 جفت باز تبديل و مولتي­مرهایي را تشكيل داده كه اين قطعات در ژل مي­ توانند با استفاده از ژل الكتروفورز آگاروز به شكل يك نردبان  مشخص گردند.

نتايج حاضر براي اولين بار نشان داده است كه بيان پروتئين Bax  به عنوان يك ژن پروآپوپتوتيكي به طور معني­داري توسط مرفين درغلظت 1 ميلي مولار و پس از مدت 96 ساعت افزايش يافته است در صورتي كه در بيان پروتئين Bcl2 تغيير معني­داري مشاهده نگرديد.

براي توضيح مكانيزم احتمالي نوروتوكسيسيته ناشي از مرفين شواهد قوي وجود دارد كه اپيوئيدها موجب بالا رفتن ROS در سلول­هاي PC12 مي­گردند.

مكانيزم ­هاي ديگري نيز شامل تغيير در فعاليت آدنيلات سيكلاز و پروتئين­كينازA مي­تواند در مرگ ناشي از مرفين در آپوپتوز نخاع نقش داشته باشد. همچنين اخيراً مشاهده شده است كه هروئين خياباني نيز مي­تواند موجب اختلال ميتوكندريایي و آپوپتوز در نورون­هاي كورتكس گردد. به طور مشابهي نارسایي ميتوكندريایي و فعال شدن كاسپازها در نورون­هاي كورتكس در پاسخ با كوكائين و يا آمفتامين نيز گزارش شده است.

نتايج قبلي همچنين پيشنهاد مي­نمايد كه مرگ سلول­هاي تمايز يافتة PC12  در پاسخ به داروي آمفتامين به ميزان ترشح دوپامين در اين سلول­ها مرتبط مي­باشد. همچنين شواهدي وجود دارد كه ROS مي­تواند موجب تغيير پتانسيل غشاء توسط باز نمودن منافذ ميتوكندريایي نفوذپذير (mPTP) كه موجب رهايش سيتوكروم C و آبشار سيگنالي پس از آن خواهد شد. بر اساس نتايج به دست آمده در مطالعة حاضر و با استناد به مطالعات قبلي مي­توان حدس زد كه اپيوئيدها ممكن است كه از طريق ROS و احتمالاً كلسيم و همچنين بيان بالاي  Baxبه عنوان يك پروتئين تسهيل كنندة آپوپتوز، موجب رها شدن مدياتورهاي ميتوكندريایي مانند سيتوكروم C شده كه يك مسير وابسته به كاسپاز را فعال مي­نمايد. از طرف ديگر آپوپتوز ممكن است همچنين توسط يك اندونوكلئازG  كه موجب شكسته شدن DNA مي­گردد، ايجاد گردد.

نهايتاً ممكن است نتيجه­ گيري نمود كه مرفين مي­تواند باعث مرگ سلولي PC12  گرديده كه در آن آپوپتوز نقش مهمي را توسط بيان بالاي Bax و احتمالاً از طريق باز نمودن mPTP و كاسپازها ودر نتيجه يك مسير وابسته به كاسپاز از طرفي و همچنين شكسته شدن DNA توسط فعال نمودن اندونوكلئاز G كي يك مسير غيروابسته به كاسپاز است از طرف ديگر گردد.